Hemocyanin of the molluscan Concholepas concholepas exhibits an unusual heterodecameric array of subunits.
Concholepas concholepas
Becker, M. I., De Ioannes, A. E, De Ioannes, P, Faunes, F, Moltedo, B, Oliva, H, Pacheco, R
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021925820855914
Describimos aquí la estructura de la hemocianina del gasterópodo chileno Concholepas concholepas (CCH), enfatizando algunos atributos que la hacen interesante entre las hemocianinas de moluscos. El CCH exhibe una estructura didecamérica predominante como lo revela la microscopía electrónica y un tamaño de 8 MDa por filtración en gel y, a diferencia de otras hemocianinas de moluscos, su estabilización no requiere Ca2+ y/o Mg2+ adicionales en el medio. Los estudios de electroforesis en gel de poliacrilamida, los análisis mediante una columna MonoQ FPLC y las transferencias Western con anticuerpos monoclonales específicos mostraron que el CCH está formado por dos subunidades unidas de forma no covalente, denominadas CCH-A y CCH-B, con masas moleculares de 405 y 350 kDa, respectivamente. Curiosamente, una de las subunidades sufre cambios dentro de la macromolécula; Demostramos que CCH-A tiene un sitio de autoescisión que, en condiciones reductoras, se escinde para producir dos polipéptidos, CCH-A1 (300 kDa) y CCH-A2 (108 kDa), mientras que CCH-B permanece sin cambios. La mella CCH-A se produce a 4 °C, aumenta a 37 °C y no se inhibe mediante la adición de inhibidores de proteasa y/o cationes divalentes. Dado que la estructura del CCH es un heterodímero, investigamos si las subunidades estarían entremezcladas, formando heterodecámeros, o ensambladas como dos decámeros homogéneos. Los estudios de dispersión de luz y microscopio electrónico de la reasociación in vitro de subunidades de CCH purificadas demostraron que la única adición de Mg2+ es necesaria para su reensamblaje en la molécula decamérica nativa; no se encontró reorganización de homodecámeros ni con las subunidades CCH-A ni con CCH-B solas. Nuestra evidencia mostró que la hemocianina de C. concholepas es un ejemplo inusual de organización heterodecamérica.
We describe here the structure of the hemocyanin from the Chilean gastropod Concholepas concholepas (CCH), emphasizing some attributes that make it interesting among molluscan hemocyanins. CCH exhibits a predominant didecameric structure as revealed by electron microscopy and a size of 8 MDa by gel filtration, and, in contrast with other mollusc hemocyanins, its stabilization does not require additional Ca2+ and/or Mg2+ in the medium. Polyacrylamide gel electrophoresis studies, analyses by a MonoQ FPLC column, and Western blots with specific monoclonal antibodies showed that CCH is made by two subunits noncovalently linked, named CCH-A and CCH-B, with molecular masses of 405 and 350 kDa, respectively. Interestingly, one of the subunits undergoes changes within the macromolecule; we demonstrated that CCH-A has an autocleavage site that under reducing conditions is cleaved to yield two polypeptides, CCH-A1 (300 kDa) and CCH-A2 (108 kDa), whereas CCH-B remains unchanged. The CCH-A nick occurs at 4 °C, increases at 37 °C, and is not inhibited by the addition of protease inhibitors and/or divalent cations. Since the CCH structure is a heterodimer, we investigated whether subunits would be either intermingled, forming heterodecamers, or assembled as two homogeneous decamers. Light scattering and electron microscope studies of the in vitro reassociation of purified CCH subunits demonstrated that the sole addition of Mg2+ is needed for its reassembly into the native decameric molecule; no homodecamer reorganization was found with either CCH-A or CCH-B subunits alone. Our evidence showed that C. concholepas hemocyanin is an unusual example of heterodecameric organization.
