Estudios estructurales de la hemocianina de Concholepas concholepas: un enfoque combinado de las técnicas de cristalografía de rayos X y CRYO-EM.
Concholepas concholepas
Muñoz Muñoz, S. M.
https://repositorio.uchile.cl/handle/2250/192000
Las hemocianinas son glicoproteínas multiméricas cilíndricas de alto peso molecular que se encuentran disueltas libremente en la hemolinfa de moluscos y artrópodos. Las hemocianinas de molusco se encuentran entre las proteínas más grandes conocidas, con masas moleculares entre 3,3 a 13,5 MDa, y presentan una compleja organización estructural. Su estructura cuaternaria corresponde a un didecámero, formado por una o dos subunidades distintas (homodidecámero y heterodidecámero respectivamente), y, a su vez, cada subunidad está formada por 8 dominios globulares con centros de unión a cobre llamados unidades funcionales (FU). Actualmente, las hemocianinas son usadas en aplicaciones biomédicas y clínicas como inmunoestimulantes naturales, no tóxicos y no específicos. En este contexto, en Chile se ha determinado que la hemocianina del gastrópodo litoral Concholepas concholepas (CCH) posee características que la hacen más efectiva que las de otras especies en inducir respuestas inmunológicas en estudios preclínicos de inmunocastración y vacunas contra cáncer prostático. Sin embargo, a la fecha, no hay información empírica reportada acerca de su estructura. Solo se dispone de caracterizaciones bioquímicas que indican que CCH corresponde a un heterodidecámero, con dos subunidades diferentemente glicosiladas, llamadas CCHA (405 KDa) y CCHB (350 KDa). Más aún, casi la totalidad de la secuencia de CCH permanece desconocida. Por ello se propuso obtener la estructura cristalográfica de al menos una FU de origen recombinante a partir de los 2 fragmentos de secuencias disponibles y determinar la organización tridimensional de las subunidades en un mapa del heterodidecámero de CCH, obtenido por crio-EM.
Dado que no fue posible obtener una FU expresada de manera recombinante en E. coli, se purificó una FU silvestre a partir de la subunidad CCHB de CCH y se requieren su estructura cristalográfica con resolución atómica (1,5 Å). Esto permitió su secuencia, identificándola como CCHB-g, permitió determinar un árbol de N-glicosilaciones identificando la presencia de monómeros de fucosa, siendo la primera estructura tridimensional de FU de hemocianina en presentar este tipo de glicosilación, y, además, permitió analizar en detalle las distancias y ángulos de las interacciones químicas presentes en el centro de unión a cobre. La comparación de este centro con el presente en la estructura cristalográfica de FU de hemocianina de pulpo reportada a 2,3 Å de resolución reveló diferencias de hasta 0,3 Å en distancias y de hasta 11° en ángulos de enlace.
Por otra parte, se obtuvo un mapa de crio-EM de CCH a resolución cercana a la atómica (3,2 Å) que corresponde al mapa de mayor resolución reportado para una hemocianina de molusco. Además, utilizando la estructura cristalográfica de la FU, generamos el primer modelo de organización de subunidades de una hemocianina heterodidecámerica, situando las subunidades CCHA hacia ambos extremos del cilindro del didecámero y las subunidades CCHB ubicadas hacia el interior del cilindro.
La información estructural presentada en este trabajo no solo será fundamental para las futuras aplicaciones de CCH en medicina y biotecnología, sino que será un aporte para el estudio estructural de las hemocianinas de molusco.
Las hemocianinas son glicoproteínas multiméricas cilíndricas de alto peso molecular que se encuentran disueltas libremente en la hemolinfa de moluscos y artrópodos. Las hemocianinas de molusco se encuentran entre las proteínas más grandes conocidas, con masas moleculares entre 3,3 a 13,5 MDa, y presentan una compleja organización estructural. Su estructura cuaternaria corresponde a un didecámero, formado por una o dos subunidades distintas (homodidecámero y heterodidecámero respectivamente), y, a su vez, cada subunidad está formada por 8 dominios globulares con centros de unión a cobre llamados unidades funcionales (FU). Actualmente, las hemocianinas son usadas en aplicaciones biomédicas y clínicas como inmunoestimulantes naturales, no tóxicos y no específicos. En este contexto, en Chile se ha determinado que la hemocianina del gastrópodo litoral Concholepas concholepas (CCH) posee características que la hacen más efectiva que las de otras especies en inducir respuestas inmunológicas en estudios preclínicos de inmunocastración y vacunas contra cáncer prostático. Sin embargo, a la fecha, no hay información empírica reportada acerca de su estructura. Solo se dispone de caracterizaciones bioquímicas que indican que CCH corresponde a un heterodidecámero, con dos subunidades diferentemente glicosiladas, llamadas CCHA (405 KDa) y CCHB (350 KDa). Más aún, casi la totalidad de la secuencia de CCH permanece desconocida. Por ello se propuso obtener la estructura cristalográfica de al menos una FU de origen recombinante a partir de los 2 fragmentos de secuencias disponibles y determinar la organización tridimensional de las subunidades en un mapa del heterodidecámero de CCH, obtenido por cryo-EM.
Dado que no fue posible obtener una FU expresada de manera recombinante en E. coli, se purificó una FU silvestre a partir de la subunidad CCHB de CCH y se determinó su estructura cristalográfica con resolución atómica (1,5 Å). Esto permitió obtener su secuencia, identificándola como CCHB-g, permitió determinar un árbol de N- glicosilaciones identificando la presencia de monómeros de fucosa, siendo la primera estructura tridimensional de FU de hemocianina en presentar este tipo de glicosilación, y, además, permitió analizar en detalle las distancias y ángulos de las interacciones químicas presentes en el centro de unión a cobre. La comparación de este centro con el presente en la estructura cristalográfica de FU de hemocianina de pulpo reportada a 2,3 Å de resolución reveló diferencias de hasta 0,3 Å en distancias y de hasta 11° en ángulos de enlace.
Por otra parte, se obtuvo un mapa de cryo-EM de CCH a resolución cercana a la atómica (3,2 Å) que corresponde al mapa de mayor resolución reportado para una hemocianina de molusco. Además, utilizando la estructura cristalográfica de la FU, generamos el primer modelo de organización de subunidades de una hemocianina heterodidecámerica, situando las subunidades CCHA hacia ambos extremos del cilindro del didecámero y las subunidades CCHB ubicadas hacia el interior del cilindro.
La información estructural presentada en este trabajo no solo será fundamental para las futuras aplicaciones de CCH en medicina y biotecnología, sino que será un aporte para el estudio estructural de las hemocianinas de molusco.
